Mechanizm kinetyczny reakcji w stanie stacjonarnym katalizowanej przez dehydrogenazę oktopinową [N2-(1-karboksyetylo)-L-arginina:NAD+ oksydoreduktaza] badano przy pH 6,9 i 9,2 w badaniach hamowania substratu, hamowania analogu i hamowania produktu . W kierunku syntezy oktopiny wzory inhibicji w obecności deltaguanidowalerianu i propionianu pokazują, że NADH wiąże się najpierw z enzymem, a następnie z L-argininą i pirogronianem, które wiążą się losowo.
W kierunku utleniania oktopiny wzorce substratów pokazują, że NAD wiąże się z enzymem przed oktopiną w szybki sposób w stanie równowagi, a wzorce inhibicji produktu pokazują, że produkty L-arginina i pirogronian są uwalniane w sposób losowy. Wykazano, że podwójne, synergistyczne hamowanie substratu przez L-argininę i pirogronian jest spowodowane wiązaniem (hipotetycznie iminy) z wolnym enzymem i kompleksem enzym-NAD. Ponadto wykazano alternatywny szlak o mniejszym znaczeniu, który obejmuje kompleks enzym-NADH-oktopina i kompleks enzym-oktopina
Dehydrogenaza oktopinowa (OcDH) z mięśnia przywodziciela przegrzebka olbrzymiego, Pecten maximus, katalizuje zależną od NADH, redukcyjną kondensację L-argininy i pirogronianu do oktopiny, NAD(+) i wody podczas pływania ucieczkowego i/lub późniejszej regeneracji.
- Niedawno rozwiązano strukturę OcDH i zaproponowano mechanizm reakcji, który implikował uporządkowane wiązanie NADH, L-argininy i wreszcie pirogronianu. W tym przypadku kolejność wiązania substratu, a także leżące u podstaw zmiany konformacyjne zostały zbadane za pomocą NMR, potwierdzając model wyprowadzony ze struktur krystalicznych. Ponadto określono strukturę krystaliczną kompleksu OcDH/NADH/agmatyna, co sugeruje kluczową rolę łańcucha bocznego L-argininy w katalizie białek.
- W ten sposób można teraz szczegółowo opisać kolejność wiązania substratu z OcDH, a także sygnały molekularne zaangażowane w tworzenie oktopiny.
- Dehydrogenaza oktopinowa [N(2)-(D-1-karboksyetylo)-L-arginina:NAD(+) oksydoreduktaza] (OcDH) z mięśnia przywodziciela przegrzebka wielkiego Pecten maximus katalizuje redukcyjną kondensację l-argininy i pirogronianu do oktopina podczas pływania ucieczkowego.
- Enzym ten, będący prototypem dehydrogenaz opinowych (OpDH), utlenia NADH pochodzący z glikolizy do NAD(+), podtrzymując w ten sposób beztlenowe dostarczanie ATP podczas krótkich okresów wzmożonej aktywności mięśni. W przeciwieństwie do niektórych innych OpDH, OcDH wykorzystuje tylko l-argininę jako substrat aminokwasowy.
- W tym miejscu opisujemy struktury krystaliczne OcDH w kompleksie z NADH i kompleksami binarnymi NADH/l-arginina i NADH/pirogronian, dostarczając szczegółowych informacji na temat zasad rozpoznawania substratu, wiązania ligandów i mechanizmu reakcji.
- OcDH wiąże swoje substraty poprzez połączenie sił elektrostatycznych i doboru wielkości, co gwarantuje, że kataliza OcDH przebiega z selektywnością substratową i stereoselektywnością, dając początek drugiemu centrum chiralnemu i wykorzystując mechanizm „linii molekularnej”.
cDNA dla dehydrogenazy oktopinowej (ODH) z mięśnia przywodziciela przegrzebka olbrzymiego, Pecten maximus, sklonowano przy użyciu 5′- i 3′-RACE. cDNA zawiera ORF o długości 1197 nukleotydów, a wydedukowana sekwencja aminokwasowa koduje białko o długości 399 aminokwasów.
ODH ulegał heterologicznej ekspresji w Escherichia coli z C-końcowym penta-tagiem His. ODH-5His oczyszczono do jednorodności stosując chromatografię powinowactwa z chelatem metalu i filtrację żelową Sephadex G-100. Rekombinowany ODH miał właściwości kinetyczne podobne do ODH typu dzikiego wyizolowanego z mięśnia przywodziciela przegrzebka. Do wyjaśnienia udziału kilku reszt aminokwasowych w reakcji katalizowanej przez ODH zastosowano ukierunkowaną mutagenezę. Cys148, która jest konserwowana we wszystkich znanych do tej pory dehydrogenazach opinowych, została przekształcona w serynę lub alaninę, co pokazuje, że ta pozostałość nie jest z natury istotna dla katalizy.
His212, Arg324 i Asp329, które są również konserwowane we wszystkich znanych sekwencjach dehydrogenazy opinowej, poddano ukierunkowanej mutagenezie. Modyfikacja tych reszt ujawniła ich znaczenie dla aktywności katalitycznej enzymu. Konwersja każdej z tych reszt do alaniny spowodowała silny wzrost wartości K(m) i spadek wartości k(cat) dla pirogronianu i L-argininy, ale miała niewielki wpływ na wartości K(m) i k(cat) dla NADH .
Zakładając podobną strukturę ODH w porównaniu z jedyną dostępną strukturą bakteryjnej dehydrogenazy opinowej, te trzy aminokwasy mogą funkcjonować jako triada katalityczna w ODH, podobna do tej występującej w dehydrogenazie mleczanowej lub dehydrogenazie jabłczanowej. Grupa karboksylowa pirogronianu jest następnie stabilizowana przez Arg324. Oprócz orientowania substratu, His212 będzie działał jako katalizator kwasowo-zasadowy, oddając proton grupie karbonylowej pirogronianu. Kwasowość tej histydyny dodatkowo zwiększa bliskość Asp32.
Maximum Recovery Diluent (MRD) |
|||
| MED1376 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 30 EUR |
cBSA *Optimized for Maximum Immunization Response* |
|||
| 5600 | AAT Bioquest | 10 mg | 222 EUR |
cOVA *Optimized for Maximum Immunization Response* |
|||
| 5605 | AAT Bioquest | 10 mg | 222 EUR |
hOVA *Optimized for Maximum Immunization Response* |
|||
| 5606 | AAT Bioquest | 10 mg | 222 EUR |
cBSA *Optimized for Maximum Immunization Response* |
|||
| 5600-10mg | AAT Bioquest | 10 mg | 222 EUR |
hBSA *Optimized for Maximum Immunization Response* |
|||
| 5601-10mg | AAT Bioquest | 10 mg | 222 EUR |
cOVA *Optimized for Maximum Immunization Response* |
|||
| 5605-10mg | AAT Bioquest | 10 mg | 222 EUR |
hOVA *Optimized for Maximum Immunization Response* |
|||
| 5606-10mg | AAT Bioquest | 10 mg | 222 EUR |
MAX Recombinant Protein (Rat) |
|||
| RP210977 | ABM | 100 ug | Ask for price |
MAX Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP018883 | ABM | 100 ug | Ask for price |
MAX Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP018886 | ABM | 100 ug | Ask for price |
MAX Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP018889 | ABM | 100 ug | Ask for price |
MAX Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP018892 | ABM | 100 ug | Ask for price |
MAX Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP018895 | ABM | 100 ug | Ask for price |
MAX Recombinant Protein (Mouse) |
|||
| RP149615 | ABM | 100 ug | Ask for price |
MAX Recombinant Protein (Mouse) |
|||
| RP149618 | ABM | 100 ug | Ask for price |
Oct-1 recombinant monoclonal antibody |
|||
| A5840 | Bimake | 100ul X 3 | 714 EUR |
PECAM1 Recombinant Protein |
|||
| 96-093 | ProSci | 0.1 mg | 588.3 EUR |
PECAM1 Recombinant Protein |
|||
| 96-095 | ProSci | 0.2 mg | 714.3 EUR |
PECR Recombinant Protein (Rat) |
|||
| RP220010 | ABM | 100 ug | Ask for price |
PECAM-1 Recombinant Protein |
|||
| 40-528-001mg | ProSci | 0.01 mg | 311.1 EUR |
PECAM-1 Recombinant Protein |
|||
| 40-528-005mg | ProSci | 0.05 mg | 437.1 EUR |
PECAM1 Recombinant Protein (Rat) |
|||
| RP220007 | ABM | 100 ug | Ask for price |
PECR Recombinant Protein (Mouse) |
|||
| RP161288 | ABM | 100 ug | Ask for price |
PECI Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP023047 | ABM | 100 ug | Ask for price |
PECI Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP023050 | ABM | 100 ug | Ask for price |
PECR Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP023053 | ABM | 100 ug | Ask for price |
PECAM1 Recombinant Protein (Mouse) |
|||
| RP161282 | ABM | 100 ug | Ask for price |
PECAM1 Recombinant Protein (Mouse) |
|||
| RP161285 | ABM | 100 ug | Ask for price |
PECAM1 Recombinant Protein (Human) |
|||
| RP082794 | ABM | 100 ug | Ask for price |
Recombinant Candida Albicans OCT1 Protein (aa 1-783) |
|||
| VAng-Lsx05781-inquire | Creative Biolabs | inquire | Ask for price |
Recombinant Octamer Binding Transcription Factor 1 (OCT1) |
|||
| 4-RPB553Hu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Octamer Binding Transcription Factor 1 (OCT1) |
|||
| 4-RPB553Mu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Octamer Binding Transcription Factor 2 (OCT2) |
|||
| 4-RPB554Hu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Octamer Binding Transcription Factor 2 (OCT2) |
|||
| 4-RPB554Ra01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Octamer Binding Transcription Factor 4 (OCT4) |
|||
| 4-RPA424Mu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Octamer Binding Transcription Factor 4 (OCT4) |
|||
| 4-RPA424Hu01 | Cloud-Clone |
|
|
Genorise® Recombinant Mouse POU5f1 (Oct-4) protein |
|||
| GR124037 | Genorise Scientific | 5 µg | 285 EUR |
Genorise® Recombinant human POU5f1 (Oct-4) protein |
|||
| GR119037 | Genorise Scientific | 5 µg | 285 EUR |
Recombinant Human PECAM-1 Protein |
|||
| PROTP16284-1 | BosterBio | 50ug | 380.4 EUR |
Recombinant MYC Associated Factor X (MAX) |
|||
| 4-RPH676Hu01 | Cloud-Clone |
|
|
Genorise® Recombinant monkey POU5f1 (Oct-4) protein |
|||
| GR175048 | Genorise Scientific | 5 mg | 285 EUR |
Recombinant Human CD31/PECAM1 Protein |
|||
| RP00096 | Abclonal | 20 μg | 219.6 EUR |
Recombinant Human MAX Protein, His, E.coli-1mg |
|||
| QP12653-1mg | EnQuireBio | 1mg | 2774.4 EUR |
Recombinant Human MAX Protein, His, E.coli-5ug |
|||
| QP12653-5ug | EnQuireBio | 5ug | 186 EUR |
Recombinant MAX Gene Associated Protein (MgA) |
|||
| 4-RPB229Hu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Human MAX Protein, His, E.coli-25ug |
|||
| QP12653-25ug | EnQuireBio | 25ug | 241.2 EUR |
Human CellExp? PECAM-1, Human Recombinant |
|||
| 7184-10 | Biovision | each | 183.6 EUR |
Human CellExp? PECAM-1, Human Recombinant |
|||
| 7184-50 | Biovision | each | 457.2 EUR |
Recombinant Ornithine Carbamoyl Transferase (OCT) |
|||
| 4-RPB492Hu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Ornithine Carbamoyl Transferase (OCT) |
|||
| 4-RPB492Mu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Human PECI Protein, His, E.coli-1mg |
|||
| QP13003-1mg | EnQuireBio | 1mg | 2774.4 EUR |
Recombinant Human PECI Protein, His, E.coli-5ug |
|||
| QP13003-5ug | EnQuireBio | 5ug | 186 EUR |
Recombinant Human PECR Protein, His, E.coli-1mg |
|||
| QP13004-1mg | EnQuireBio | 1mg | 3308.4 EUR |
Recombinant Human PECR Protein, His, E.coli-5ug |
|||
| QP13004-5ug | EnQuireBio | 5ug | 186 EUR |
Recombinant Human OCT Protein, Untagged, E.coli-1mg |
|||
| QP12920-1mg | EnQuireBio | 1mg | 186 EUR |
Recombinant Human OCT Protein, Untagged, E.coli-5mg |
|||
| QP12920-5mg | EnQuireBio | 5mg | 337.2 EUR |
Recombinant Human PECI Protein, His, E.coli-25ug |
|||
| QP13003-25ug | EnQuireBio | 25ug | 241.2 EUR |
Recombinant Human PECR Protein, His, E.coli-20ug |
|||
| QP13004-20ug | EnQuireBio | 20ug | 241.2 EUR |
Recombinant Human OCT Protein, Untagged, E.coli-25mg |
|||
| QP12920-25mg | EnQuireBio | 25mg | 1154.4 EUR |
Recombinant Humanp21 Recombinant Protein |
|||
| 92-035 | ProSci | 0.05 mg | 821.4 EUR |
MAX MYC Associated Factor X Human Recombinant Protein |
|||
| PROTP61244 | BosterBio | Regular: 25ug | 380.4 EUR |
Recombinant Human PECAM1 Protein, His, Insect-1mg |
|||
| QP13002-1mg | EnQuireBio | 1mg | 6301.2 EUR |
Recombinant Human PECAM1 Protein, His, Insect-2ug |
|||
| QP13002-2ug | EnQuireBio | 2ug | 186 EUR |
Recombinant Human PECAM1 Protein, His, Insect-10ug |
|||
| QP13002-10ug | EnQuireBio | 10ug | 241.2 EUR |
Recombinant Human Myc-Associated Factor X/MAX (C-6His) |
|||
| C196-10ug | Novoprotein | 10ug | 187.2 EUR |
Recombinant Human Myc-Associated Factor X/MAX (C-6His) |
|||
| C196-1mg | Novoprotein | 1mg | 2739.6 EUR |
Recombinant Human Myc-Associated Factor X/MAX (C-6His) |
|||
| C196-500ug | Novoprotein | 500ug | 1935.6 EUR |
Recombinant Human Myc-Associated Factor X/MAX (C-6His) |
|||
| C196-50ug | Novoprotein | 50ug | 442.8 EUR |
TAGLN Recombinant Protein (Rat) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP232205 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN2 Recombinant Protein (Rat) (Recombinant Tag) |
|||
| RP232208 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN3 Recombinant Protein (Rat) (Recombinant Tag) |
|||
| RP232211 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN3 Recombinant Protein (Rat) (Recombinant Tag) |
|||
| RP232214 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGAP Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP177155 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP177161 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGAP Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP043930 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGAP Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP030880 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP030883 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP030886 | ABM | 100 ug | Ask for price |
MXD3 MAX Dimerization Protein 3 Human Recombinant Protein |
|||
| PROTQ9BW11 | BosterBio | Regular: 20ug | 380.4 EUR |
Tagap1 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant Tag) |
|||
| RP177158 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN2 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant Tag) |
|||
| RP177164 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN3 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant Tag) |
|||
| RP177167 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE1 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP008266 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP008269 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGEP Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP008275 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP126449 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP126452 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP126455 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE4 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP053403 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE8 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP053409 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE9 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP053412 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAG1A Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP038332 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAG1B Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP038335 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
| RP038338 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN2 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
| RP030889 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN2 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
| RP030892 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN3 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
| RP030895 | ABM | 100 ug | Ask for price |
Glyco Recombinant Protein A33 Recombinant Protein |
|||
| 96-361 | ProSci | 0.05 mg | 619.8 EUR |
Glyco Recombinant Protein A33 Recombinant Protein |
|||
| 96-364 | ProSci | 0.05 mg | 619.8 EUR |
Stereospecyficzność dehydrogenazy oktopinowej z guza żółciowego korony i dehydrogenazy oktopinowej z przegrzebków (maksimum Pectena) w odniesieniu do utleniania C-4 pierścienia dihydronikotynamidowego NADH badano poprzez określenie rozkładu radioaktywności po utlenieniu (4R)- i (4S)-[4-3H]NADH. Dehydrogenaza oktopinowa z guza koronowego i przegrzebków stereospecyficznie usuwa atom wodoru pro-S pierścienia dihydronikotynamidu z przeniesieniem znacznika do rozpuszczalnika i do produktu oktopiny (N-2-(1-karboksyetylo)-L-arginina). Chociaż w mniejszym stopniu, wymiana znacznika z (4S)-[4-3H]NADH z rozpuszczalnikiem wystąpiła, gdy dehydrogenaza oktopinowa z guza żółciowego korony lub z przegrzebków była inkubowana bez innych substratów. Omówiono możliwe mechanizmy wyjaśniające tę wymianę.