Mechanizm kinetyczny reakcji w stanie stacjonarnym katalizowanej przez dehydrogenazę oktopinową [N2-(1-karboksyetylo)-L-arginina:NAD+ oksydoreduktaza] badano przy pH 6,9 i 9,2 w badaniach hamowania substratu, hamowania analogu i hamowania produktu . W kierunku syntezy oktopiny wzory inhibicji w obecności deltaguanidowalerianu i propionianu pokazują, że NADH wiąże się najpierw z enzymem, a następnie z L-argininą i pirogronianem, które wiążą się losowo.
W kierunku utleniania oktopiny wzorce substratów pokazują, że NAD wiąże się z enzymem przed oktopiną w szybki sposób w stanie równowagi, a wzorce inhibicji produktu pokazują, że produkty L-arginina i pirogronian są uwalniane w sposób losowy. Wykazano, że podwójne, synergistyczne hamowanie substratu przez L-argininę i pirogronian jest spowodowane wiązaniem (hipotetycznie iminy) z wolnym enzymem i kompleksem enzym-NAD. Ponadto wykazano alternatywny szlak o mniejszym znaczeniu, który obejmuje kompleks enzym-NADH-oktopina i kompleks enzym-oktopina
Dehydrogenaza oktopinowa (OcDH) z mięśnia przywodziciela przegrzebka olbrzymiego, Pecten maximus, katalizuje zależną od NADH, redukcyjną kondensację L-argininy i pirogronianu do oktopiny, NAD(+) i wody podczas pływania ucieczkowego i/lub późniejszej regeneracji.
- Niedawno rozwiązano strukturę OcDH i zaproponowano mechanizm reakcji, który implikował uporządkowane wiązanie NADH, L-argininy i wreszcie pirogronianu. W tym przypadku kolejność wiązania substratu, a także leżące u podstaw zmiany konformacyjne zostały zbadane za pomocą NMR, potwierdzając model wyprowadzony ze struktur krystalicznych. Ponadto określono strukturę krystaliczną kompleksu OcDH/NADH/agmatyna, co sugeruje kluczową rolę łańcucha bocznego L-argininy w katalizie białek.
- W ten sposób można teraz szczegółowo opisać kolejność wiązania substratu z OcDH, a także sygnały molekularne zaangażowane w tworzenie oktopiny.
- Dehydrogenaza oktopinowa [N(2)-(D-1-karboksyetylo)-L-arginina:NAD(+) oksydoreduktaza] (OcDH) z mięśnia przywodziciela przegrzebka wielkiego Pecten maximus katalizuje redukcyjną kondensację l-argininy i pirogronianu do oktopina podczas pływania ucieczkowego.
- Enzym ten, będący prototypem dehydrogenaz opinowych (OpDH), utlenia NADH pochodzący z glikolizy do NAD(+), podtrzymując w ten sposób beztlenowe dostarczanie ATP podczas krótkich okresów wzmożonej aktywności mięśni. W przeciwieństwie do niektórych innych OpDH, OcDH wykorzystuje tylko l-argininę jako substrat aminokwasowy.
- W tym miejscu opisujemy struktury krystaliczne OcDH w kompleksie z NADH i kompleksami binarnymi NADH/l-arginina i NADH/pirogronian, dostarczając szczegółowych informacji na temat zasad rozpoznawania substratu, wiązania ligandów i mechanizmu reakcji.
- OcDH wiąże swoje substraty poprzez połączenie sił elektrostatycznych i doboru wielkości, co gwarantuje, że kataliza OcDH przebiega z selektywnością substratową i stereoselektywnością, dając początek drugiemu centrum chiralnemu i wykorzystując mechanizm „linii molekularnej”.
cDNA dla dehydrogenazy oktopinowej (ODH) z mięśnia przywodziciela przegrzebka olbrzymiego, Pecten maximus, sklonowano przy użyciu 5′- i 3′-RACE. cDNA zawiera ORF o długości 1197 nukleotydów, a wydedukowana sekwencja aminokwasowa koduje białko o długości 399 aminokwasów.
ODH ulegał heterologicznej ekspresji w Escherichia coli z C-końcowym penta-tagiem His. ODH-5His oczyszczono do jednorodności stosując chromatografię powinowactwa z chelatem metalu i filtrację żelową Sephadex G-100. Rekombinowany ODH miał właściwości kinetyczne podobne do ODH typu dzikiego wyizolowanego z mięśnia przywodziciela przegrzebka. Do wyjaśnienia udziału kilku reszt aminokwasowych w reakcji katalizowanej przez ODH zastosowano ukierunkowaną mutagenezę. Cys148, która jest konserwowana we wszystkich znanych do tej pory dehydrogenazach opinowych, została przekształcona w serynę lub alaninę, co pokazuje, że ta pozostałość nie jest z natury istotna dla katalizy.
His212, Arg324 i Asp329, które są również konserwowane we wszystkich znanych sekwencjach dehydrogenazy opinowej, poddano ukierunkowanej mutagenezie. Modyfikacja tych reszt ujawniła ich znaczenie dla aktywności katalitycznej enzymu. Konwersja każdej z tych reszt do alaniny spowodowała silny wzrost wartości K(m) i spadek wartości k(cat) dla pirogronianu i L-argininy, ale miała niewielki wpływ na wartości K(m) i k(cat) dla NADH .
Zakładając podobną strukturę ODH w porównaniu z jedyną dostępną strukturą bakteryjnej dehydrogenazy opinowej, te trzy aminokwasy mogą funkcjonować jako triada katalityczna w ODH, podobna do tej występującej w dehydrogenazie mleczanowej lub dehydrogenazie jabłczanowej. Grupa karboksylowa pirogronianu jest następnie stabilizowana przez Arg324. Oprócz orientowania substratu, His212 będzie działał jako katalizator kwasowo-zasadowy, oddając proton grupie karbonylowej pirogronianu. Kwasowość tej histydyny dodatkowo zwiększa bliskość Asp32.
Recombinant Humanp21 Recombinant Protein |
|||
92-035 | ProSci | 0.05 mg | 821.4 EUR |
Recombinant phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) (Recombinant) |
|||
20-abx072018 | Abbexa |
|
|
Glyco Recombinant Protein A33 Recombinant Protein |
|||
96-361 | ProSci | 0.05 mg | 619.8 EUR |
Glyco Recombinant Protein A33 Recombinant Protein |
|||
96-364 | ProSci | 0.05 mg | 619.8 EUR |
STAG3L1 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP030283 | ABM | 100 ug | Ask for price |
STAG3L2 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP030286 | ABM | 100 ug | Ask for price |
STAG3L3 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP030289 | ABM | 100 ug | Ask for price |
STAG3L4 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP030292 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGAP Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP030880 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP030883 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP030886 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN2 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP030889 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN2 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP030892 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN3 Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP030895 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAG1A Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP038332 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAG1B Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP038335 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP038338 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGAP Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP043930 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE1 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP008266 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP008269 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE6P Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP008272 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGEP Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP008275 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN Recombinant Protein (Rat) (Recombinant- Tag) |
|||
RP232205 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN2 Recombinant Protein (Rat) (Recombinant Tag) |
|||
RP232208 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN3 Recombinant Protein (Rat) (Recombinant Tag) |
|||
RP232211 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN3 Recombinant Protein (Rat) (Recombinant Tag) |
|||
RP232214 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE3P Recombinant Protein (Human) (Recombinant Tag) |
|||
RP053400 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE4 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP053403 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE8 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP053409 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE9 Recombinant Protein (Human) (Recombinant- Tag) |
|||
RP053412 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGAP Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
RP177155 | ABM | 100 ug | Ask for price |
Tagap1 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant Tag) |
|||
RP177158 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
RP177161 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN2 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant Tag) |
|||
RP177164 | ABM | 100 ug | Ask for price |
TAGLN3 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant Tag) |
|||
RP177167 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
RP126449 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
RP126452 | ABM | 100 ug | Ask for price |
CTAGE5 Recombinant Protein (Mouse) (Recombinant- Tag) |
|||
RP126455 | ABM | 100 ug | Ask for price |
Recombinant Batroxobin |
|||
7-04504 | CHI Scientific | 10µg | Ask for price |
Recombinant Batroxobin |
|||
7-04505 | CHI Scientific | 50µg | Ask for price |
Recombinant Batroxobin |
|||
7-04506 | CHI Scientific | 1mg | Ask for price |
Recombinant Hirudin |
|||
7-05344 | CHI Scientific | 2µg | Ask for price |
Recombinant Hirudin |
|||
7-05345 | CHI Scientific | 10µg | Ask for price |
Recombinant Hirudin |
|||
7-05346 | CHI Scientific | 1mg | Ask for price |
Recombinant Streptavidin |
|||
7-06553 | CHI Scientific | 5mg | Ask for price |
Recombinant Streptavidin |
|||
7-06554 | CHI Scientific | 20mg | Ask for price |
Recombinant Streptavidin |
|||
7-06555 | CHI Scientific | 1gr | Ask for price |
Recombinant Hantavirus |
|||
7-07429 | CHI Scientific | 100µg | Ask for price |
Recombinant Hantavirus |
|||
7-07430 | CHI Scientific | 500µg | Ask for price |
Recombinant Hantavirus |
|||
7-07431 | CHI Scientific | 1000µg | Ask for price |
Recombinant Lysostaphin |
|||
7-03085 | CHI Scientific | 1mg | Ask for price |
Recombinant Lysostaphin |
|||
7-03086 | CHI Scientific | 5mg | Ask for price |
Recombinant Lysostaphin |
|||
7-03087 | CHI Scientific | 10mg | Ask for price |
Recombinant Protease |
|||
7-03484 | CHI Scientific | 50IU | Ask for price |
Recombinant Protease |
|||
7-03485 | CHI Scientific | 150IU | Ask for price |
Recombinant Protease |
|||
7-03486 | CHI Scientific | 1,000IU | Ask for price |
Recombinant Staphylokinase |
|||
7-03598 | CHI Scientific | 20µg | Ask for price |
Recombinant Staphylokinase |
|||
7-03599 | CHI Scientific | 100µg | Ask for price |
Recombinant Staphylokinase |
|||
7-03600 | CHI Scientific | 1mg | Ask for price |
Recombinant Streptokinase |
|||
7-03601 | CHI Scientific | 250,000IU | Ask for price |
Recombinant Streptokinase |
|||
7-03602 | CHI Scientific | 750,000IU | Ask for price |
Recombinant Streptokinase |
|||
7-03603 | CHI Scientific | 1.5MIU | Ask for price |
Recombinant Urease |
|||
7-03790 | CHI Scientific | 1mg | Ask for price |
Recombinant Urease |
|||
7-03791 | CHI Scientific | 5mg | Ask for price |
Recombinant Urease |
|||
7-03792 | CHI Scientific | 50mg | Ask for price |
Recombinant LukAB |
|||
0510-001 | IBT Bioservices | 100ug | 486 EUR |
Ribokinase (Recombinant) |
|||
20-abx072011 | Abbexa |
|
|
Ribokinase (Recombinant) |
|||
20-abx072012 | Abbexa |
|
|
Lysostaphin (Recombinant) |
|||
20-abx073003 | Abbexa |
|
|
Streptokinase (Recombinant) |
|||
abx073012-15MIU | Abbexa | 1.5M IU | 1395.6 EUR |
Streptokinase (Recombinant) |
|||
abx073012-250000IU | Abbexa | 250.000 IU | 526.8 EUR |
Streptokinase (Recombinant) |
|||
abx073012-750000IU | Abbexa | 750.000 IU | 861.6 EUR |
NAT6 (Recombinant) |
|||
20-abx073034 | Abbexa |
|
|
HTRA2 (Recombinant) |
|||
20-abx073047 | Abbexa |
|
|
GALE (Recombinant) |
|||
20-abx073137 | Abbexa |
|
|
AASDHPPT (Recombinant) |
|||
20-abx073160 | Abbexa |
|
|
ADSL (Recombinant) |
|||
20-abx073250 | Abbexa |
|
|
Cystathionase (Recombinant) |
|||
20-abx073257 | Abbexa |
|
|
ACOT7 (Recombinant) |
|||
20-abx073258 | Abbexa |
|
|
ACAA1 (Recombinant) |
|||
20-abx073272 | Abbexa |
|
|
Transaldolase (Recombinant) |
|||
20-abx073275 | Abbexa |
|
|
Gankyrin (Recombinant) |
|||
20-abx073293 | Abbexa |
|
|
Catalase (Recombinant) |
|||
20-abx073353 | Abbexa |
|
|
ADPRH (Recombinant) |
|||
20-abx073354 | Abbexa |
|
|
Carboxymethylenebutenolidase (Recombinant) |
|||
20-abx073357 | Abbexa |
|
|
PAFAH1B3 (Recombinant) |
|||
20-abx073360 | Abbexa |
|
|
Renalase (Recombinant) |
|||
20-abx073367 | Abbexa |
|
|
SMUG1 (Recombinant) |
|||
20-abx073377 | Abbexa |
|
|
MPST (Recombinant) |
|||
20-abx073378 | Abbexa |
|
|
TDP1 (Recombinant) |
|||
20-abx073385 | Abbexa |
|
|
MMP10 (Recombinant) |
|||
20-abx073421 | Abbexa |
|
|
MMP1 (Recombinant) |
|||
20-abx073422 | Abbexa |
|
|
ADAL (Recombinant) |
|||
20-abx073435 | Abbexa |
|
|
Klotho (Recombinant) |
|||
20-abx073512 | Abbexa |
|
|
Protease (Recombinant) |
|||
abx073528-1000IU | Abbexa | 1.000 IU | 777.6 EUR |
Protease (Recombinant) |
|||
abx073528-150IU | Abbexa | 150 IU | 393.6 EUR |
Protease (Recombinant) |
|||
abx073528-50IU | Abbexa | 50 IU | 276 EUR |
Latexin (Recombinant) |
|||
20-abx073558 | Abbexa |
|
|
Aspartoacylase (Recombinant) |
|||
20-abx073571 | Abbexa |
|
|
NDUFAF1 (Recombinant) |
|||
20-abx073578 | Abbexa |
|
|
Stereospecyficzność dehydrogenazy oktopinowej z guza żółciowego korony i dehydrogenazy oktopinowej z przegrzebków (maksimum Pectena) w odniesieniu do utleniania C-4 pierścienia dihydronikotynamidowego NADH badano poprzez określenie rozkładu radioaktywności po utlenieniu (4R)- i (4S)-[4-3H]NADH. Dehydrogenaza oktopinowa z guza koronowego i przegrzebków stereospecyficznie usuwa atom wodoru pro-S pierścienia dihydronikotynamidu z przeniesieniem znacznika do rozpuszczalnika i do produktu oktopiny (N-2-(1-karboksyetylo)-L-arginina). Chociaż w mniejszym stopniu, wymiana znacznika z (4S)-[4-3H]NADH z rozpuszczalnikiem wystąpiła, gdy dehydrogenaza oktopinowa z guza żółciowego korony lub z przegrzebków była inkubowana bez innych substratów. Omówiono możliwe mechanizmy wyjaśniające tę wymianę.