Helicobacter pylori wytwarza polarną osłonkę wici, która, jak się uważa, jest niezbędna do bakteryjnej kolonizacji błony śluzowej żołądka człowieka. Tutaj opisujemy klonowanie i charakterystykę genetyczną genu H. pylori kodującego podjednostkę włókna wici, flagelinę . Przeszukiwanie biblioteki genomowej H. pylori sondą oligonukleotydową pochodzącą z N-końcowej sekwencji aminokwasowej oczyszczonej flageliny dało zrekombinowany klon plazmidowy niosący kodujący flagelinę gen flaA na fragmencie Bg/II o wielkości 9,3 kb.
Sekwencja nukleotydowa flaA ujawniła otwartą ramkę odczytu złożoną z 1530 nukleotydów, kodującą białko o przewidywanej masie cząsteczkowej 53,2 kDa, która jest podobna pod względem wielkości do oczyszczonego białka flageliny w elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Dopasowanie sekwencji flageliny H. pylori (FlaA) z innymi flagelinami bakteryjnymi wykazuje wysoki stopień podobieństwa w regionach końca aminowego i końca karboksylowego, w tym blisko spokrewnionego rodzaju Campylobacter (56% ogólnej identyczności z Campylobacter coli flaA), ale mała homologia w domenie centralnej.
Hybrydyzacja Southern chromosomalnego DNA z sondami specyficznymi dla flaA nie ujawniła obecności dodatkowych homologicznych genów flageliny w H. pylori.
Analiza sekwencji regionów flankujących flaA i mapowanie miejsca startu mRNA flaA w eksperymencie wydłużania startera wykazały, że transkrypcja genu jest pod kontrolą sekwencji promotora specyficznej dla sigma28 w H. pylori. Region przed promotorem flaA podlega lokalnej modyfikacji DNA, co skutkuje maskowaniem dwóch z trzech blisko powiązanych miejsc restrykcyjnych Hindlll w chromosomie szczepu 898-1 . Szczepy Escherichia coli niosące zrekombinowany plazmid nie wytwarzały pełnej długości flagellina i dane uzyskane z białkami fuzyjnymi FlaA przy użyciu systemu ekspresji plazmidu E. coli sugerują, że odrębna sekwencja nukleotydów w genie zakłóca produktywną translację tego białka w E. coli.
- Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko głównemu białku flageliny Borrelia burgdorferi, flagellinie białkowej o masie 41 kilodaltonów (kDa), zastosowano do monitorowania klonowania i ekspresji genu flageliny z biblioteki genomowej Borrelia burgdorferi.
- Analizowano strukturę genu i wytworzono zrekombinowaną flagelinę niefuzyjną w Escherichia coli. Analiza sekwencji DNA genu flageliny 41 kDa wykazała obecność otwartej ramki odczytu, która kodowała białko mające 336 reszt aminokwasowych i obliczoną masę cząsteczkową 35,8 kDa, co wskazuje na potranslacyjną modyfikację naturalnej flageliny 41 kDa białko.
- W górę od sekwencji kodonu start AUG zidentyfikowaliśmy motywy odpowiadające konsensusowym prokariotycznym elementom promotora, które mogą być wykorzystane przez sklonowany gen flageliny, gdy jest eksprymowany w E. coli MC1061. Wydedukowana sekwencja białka flageliny wykazywała wysoki poziom homologii z sekwencjami białek flageliny z Bacillus subtilis i Salmonella typhimurium.
- Poziomy podobieństwa sekwencji dla części na końcu aminowym i karboksylowym wynosiły odpowiednio około 65 i 56%. Informacje o sekwencji DNA genu flageliny zostały wykorzystane do zaprojektowania oligonukleotydów do amplifikacji genu metodą reakcji łańcuchowej polimerazy, a przy użyciu tej metody można było wykryć 0,01 pg DNA Borrelia burgdorferi. Nasze wyniki stanowią podstawę do dalszej analizy biochemicznej białka flageliny o masie 41 kDa, badania roli tego białka w oddziaływaniach gospodarz-patogen oraz opracowania standaryzowanego odczynnika do systemów diagnostycznych dla zakażeń Borrelia burgdorferi.
Flagellina, monomeryczna podjednostka wici, jest induktorem mediatorów prozapalnych.
Bakteryjne geny flageliny mają konserwatywne domeny (D1 i D2) na końcu N i końcu C oraz środkową domenę hiperzmienną (D3). Aby zidentyfikować, które domeny indukują aktywność prozapalną, z genu flageliny Salmonella dublin (SD) fliC wytworzono znakowane r6-histydyną (6HIS) konstrukty fuzyjne. Pełnej długości flagelina r6HIS SD (flaga 6HIS) indukowała po stymulacji utratę IkappaBalpha i aktywację NF-kappaB w komórkach Caco-2BBe i była tak silna jak natywnie oczyszczona flagelina SD. Komórki DLD-1 stymulowane IFN-gamma stymulowane 1 mikrog/ml flagi 6HIS indukowały wysokie poziomy NO (60 +/- 0,95 mikroM) porównywalne z kombinacją IL-1beta i IFN-gamma (77 +/- 1,2) lub oczyszczona natywna flaga SD (66,3 +/- 0,98).
Wybrane białka flageliny rSD reprezentujące domeny D1, D2 lub D3 pojedynczo lub w połączeniu przetestowano pod kątem właściwości prozapalnych. Białka fuzyjne reprezentujące same regiony D3, aminowe lub karboksylowe nie indukowały mediatorów prozapalnych. Wyniki z rekombinowanym białkiem zawierającym aminokwasy D1 i D2 oraz karboksyl D1 i D2 oddzielone zawiasem Escherichia coli (ND1-2/ECH/CD2) wskazywały, że D1 i D2 były bioaktywne po sprzężeniu z elementem ECH, aby umożliwić zwijanie białka. Ta chimera, ale nie sam zawias, indukowała degradację IkappaBalpha, aktywację NF-kappaB oraz wytwarzanie NO i IL-8 w dwóch liniach komórek nabłonka jelitowego.
ND1-2/ECH/CD2-1 indukował również wysokie poziomy TNF-alfa (900 pg/ml) w ludzkich monocytach porównywalne z natywną flageliną SD (991,5 pg/ml) i flagą 6HIS (987 pg/ml). Silna prozapalna aktywność flageliny znajduje się zatem w wysoce konserwatywnych regionach D1 i D2 N i C.
Gen ospC kodujący zewnętrzne białko powierzchniowe OspC oraz gen fla kodujący flagelinę zbadano u trzech różnych szczepów Borrelia burgdorferi sensu lato.
Escherichia coli Flagellin (fliC) |
|||
1-CSB-EP300968ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Flagellin (fliC) |
|||
1-CSB-EP300968ENVe1 | Cusabio |
|
|
Escherichia coli O157:H7 flagellin (fliC) |
|||
1-CSB-EP2353EODe1 | Cusabio |
|
|
Recombinant Escherichia coli Protein (ECP) |
|||
4-RPX655Ge01 | Cloud-Clone |
|
|
Escherichia coli (E. coli) Antibody |
|||
abx415692-01mg | Abbexa | 0.1 mg | 760.8 EUR |
Escherichia coli (E. coli) Antibody |
|||
abx415712-1ml | Abbexa | 1 ml | 727.2 EUR |
Escherichia coli (E. coli) Antibody |
|||
abx411320-1ml | Abbexa | 1 ml | 610.8 EUR |
Escherichia coli (E. coli) Antibody (Biotin) |
|||
abx415713-1ml | Abbexa | 1 ml | 861.6 EUR |
Escherichia coli (E. coli) Antibody (Biotin) |
|||
abx411321-1ml | Abbexa | 1 ml | 710.4 EUR |
Escherichia coli (E. coli) Antibody (FITC) |
|||
abx411322-1ml | Abbexa | 1 ml | 610.8 EUR |
Flagellin Recombinant Protein |
|||
90-236 | ProSci | 10 ug | 437.1 EUR |
Flagellin Recombinant Protein |
|||
90-279 | ProSci | 100 ug | 537.9 EUR |
Flagellin Recombinant Protein |
|||
90-305 | ProSci | 10 ug | 468.6 EUR |
Recombinant Flagellin FlicC |
|||
VAdv-Ly0081 | Creative Biolabs | 50 µg | 2353.2 EUR |
Escherichia coli Agmatinase (speB) |
|||
1-CSB-EP001447ENM | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Ribokinase (rbsK) |
|||
1-CSB-EP019397ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Exopolyphosphatase (ppx) |
|||
1-CSB-EP365319ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli PCR kit |
|||
PCR-VHA207-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
Escherichia coli PCR kit |
|||
PCR-VHA207-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
Top10F Escherichia coli Strains |
|||
S0024 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
TG1 Escherichia coli Strains |
|||
S0026 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
HB101 Escherichia coli Strains |
|||
S0031 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
DH10B Escherichia coli Strains |
|||
S0032 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
DH10Bac Escherichia coli Strains |
|||
S0033 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
Stbl2 Escherichia coli Strains |
|||
S0034 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
Stbl3 Escherichia coli Strains |
|||
S0035 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
BJ5183 Escherichia coli Strains |
|||
S0036 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
JM110 Escherichia coli Strains |
|||
S0037 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
ER2566 Escherichia coli Strains |
|||
S0039 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
SURE Escherichia coli Strains |
|||
S0041 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
DB3.1 Escherichia coli Strains |
|||
S0043 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
TransB Escherichia coli Strains |
|||
S0045 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
Trans110 Escherichia coli Strains |
|||
S0046 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
MC1061 Escherichia coli Strains |
|||
S0047 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
T1 Escherichia coli Strains |
|||
S0048 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
EPI300 Escherichia coli Strains |
|||
S0050 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
BW25113 Escherichia coli Strains |
|||
S0051 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
BL21 Escherichia coli Strains |
|||
S0053 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
EPI400 Escherichia coli Strains |
|||
S0087 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
K802 Escherichia coli Strains |
|||
S0089 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
JM108 Escherichia coli Strains |
|||
S0105 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
HB2151 Escherichia coli Strains |
|||
S0122 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
Human Escherichia coli (E. coli) ELISA Kit |
|||
abx052493-96tests | Abbexa | 96 tests | 801.6 EUR |
Cow Escherichia coli (E. coli) ELISA Kit |
|||
abx055785-96tests | Abbexa | 96 tests | 801.6 EUR |
Flagellin, His-tagged, recombinant |
|||
RC772-13 | Bio Basic | 50ug | 203.56 EUR |
Escherichia coli Protein (ECP) Protein |
|||
20-abx066464 | Abbexa |
|
|
Escherichia Coli Protein (ECP) Antibody |
|||
20-abx102354 | Abbexa |
|
|
Escherichia Coli Protein (ECP) Antibody |
|||
20-abx218321 | Abbexa |
|
|
Escherichia coli Adenosine deaminase (add) |
|||
1-CSB-EP001268ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Adenylate cyclase (cyaA) |
|||
1-CSB-CF355580ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Colicin-E1 (cea) |
|||
1-CSB-CF360926ENL | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Malate dehydrogenase (mdh) |
|||
1-CSB-EP013623ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Peptide deformylase (def) |
|||
1-CSB-EP017707ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Phosphoserine phosphatase (serB) |
|||
1-CSB-EP018938ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Oxidoreductase YdhF (ydhF) |
|||
1-CSB-EP300544ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Glutaminase 1 (glsA1) |
|||
1-CSB-EP302868ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Antitoxin RelB (relB) |
|||
1-CSB-EP314742ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Thioredoxin-2 (trxC) |
|||
1-CSB-EP314858ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli DNA ligase (ligA) |
|||
1-CSB-EP322745ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Metalloprotease LoiP (loiP) |
|||
1-CSB-EP326582ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Protein yebF (yebF) |
|||
1-CSB-EP329240ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Phosphoenolpyruvate synthase (ppsA) |
|||
1-CSB-EP332921ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Cytosine deaminase (codA) |
|||
1-CSB-EP340707ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Transketolase 1 (tktA) |
|||
1-CSB-EP340865ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Protease 7 (ompT) |
|||
1-CSB-EP348292EOD(M) | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Phosphoheptose isomerase (gmhA) |
|||
1-CSB-EP352401ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Protease 7 (ompT) |
|||
1-CSB-EP357589ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Transaldolase B (talB) |
|||
1-CSB-EP359086ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Chaperone surA (surA) |
|||
1-CSB-EP359693ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Methionine aminopeptidase (map) |
|||
1-CSB-EP360042ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Colicin-E1 (cea) |
|||
1-CSB-EP360926ENL1 | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Cytidylate kinase (cmk) |
|||
1-CSB-EP363865ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli LexA repressor (lexA) |
|||
1-CSB-EP363985ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Adenylate kinase (adk) |
|||
1-CSB-RP163274Ba | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc) |
|||
1-CSB-RP183374Ba | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Glycerol kinase (glpK) |
|||
1-CSB-RP184074Ba | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Dihydrodipicolinate synthase (dapA) |
|||
1-CSB-RP185174Ba | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Thioredoxin-1 (trxA) |
|||
1-CSB-RP186674Ba | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Thioredoxin-2 (trxC) |
|||
1-CSB-YP314858ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Cytosine deaminase (codA) |
|||
1-CSB-YP340707ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Chaperone surA (surA) |
|||
1-CSB-YP359693ENV | Cusabio |
|
|
Escherichia coli Trigger factor (tig) |
|||
1-CSB-YP632196EGW | Cusabio |
|
|
Native Escherichia coli β-Galactosidase |
|||
DIA-189 | Creative Enzymes | 5 ku | 324 EUR |
Escherichia coli Protein ELISA Kit |
|||
ELA-E1655o | Lifescience Market | 96 Tests | 1113.6 EUR |
Escherichia coli O157H7 PCR kit |
|||
PCR-VH104-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
Escherichia coli O157H7 PCR kit |
|||
PCR-VH104-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
Escherichia coli RT PCR kit |
|||
RTq-VHA207-100D | Bioingentech | 100T | 860.4 EUR |
Escherichia coli RT PCR kit |
|||
RTq-VHA207-150D | Bioingentech | 150T | 969.6 EUR |
Escherichia coli RT PCR kit |
|||
RTq-VHA207-50D | Bioingentech | 50T | 717.6 EUR |
JM109 (DE3) Escherichia coli Strains |
|||
S0025 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
M15 (pREP4) Escherichia coli Strains |
|||
S0027 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
XL1-Blue Escherichia coli Strains |
|||
S0028 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
XL10-Gold Escherichia coli Strains |
|||
S0029 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
Tuner (DE3) Escherichia coli Strains |
|||
S0040 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
ET12567 (pUZ8002) Escherichia coli Strains |
|||
S0052 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
XL2-Blue Escherichia coli Strains |
|||
S0103 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
HT115 (DE3) Escherichia coli Strains |
|||
S0106 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
BL21/ pREP4 Escherichia coli Strains |
|||
S0123 | Lifescience Market | 100 ul | 438 EUR |
Escherichia coli 0157 Select Sup |
|||
MED1542 | Scientific Laboratory Supplies | PK10 | 31.92 EUR |
QPCR Kit DNA Escherichia coli |
|||
MOL6714 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 839.04 EUR |