Helicobacter pylori wytwarza polarną osłonkę wici, która, jak się uważa, jest niezbędna do bakteryjnej kolonizacji błony śluzowej żołądka człowieka. Tutaj opisujemy klonowanie i charakterystykę genetyczną genu H. pylori kodującego podjednostkę włókna wici, flagelinę . Przeszukiwanie biblioteki genomowej H. pylori sondą oligonukleotydową pochodzącą z N-końcowej sekwencji aminokwasowej oczyszczonej flageliny dało zrekombinowany klon plazmidowy niosący kodujący flagelinę gen flaA na fragmencie Bg/II o wielkości 9,3 kb.

Sekwencja nukleotydowa flaA ujawniła otwartą ramkę odczytu złożoną z 1530 nukleotydów, kodującą białko o przewidywanej masie cząsteczkowej 53,2 kDa, która jest podobna pod względem wielkości do oczyszczonego białka flageliny w elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Dopasowanie sekwencji flageliny H. pylori (FlaA) z innymi flagelinami bakteryjnymi wykazuje wysoki stopień podobieństwa w regionach końca aminowego i końca karboksylowego, w tym blisko spokrewnionego rodzaju Campylobacter (56% ogólnej identyczności z Campylobacter coli flaA), ale mała homologia w domenie centralnej.

Hybrydyzacja Southern chromosomalnego DNA z sondami specyficznymi dla flaA nie ujawniła obecności dodatkowych homologicznych genów flageliny w H. pylori.

Analiza sekwencji regionów flankujących flaA i mapowanie miejsca startu mRNA flaA w eksperymencie wydłużania startera wykazały, że transkrypcja genu jest pod kontrolą sekwencji promotora specyficznej dla sigma28 w H. pylori. Region przed promotorem flaA podlega lokalnej modyfikacji DNA, co skutkuje maskowaniem dwóch z trzech blisko powiązanych miejsc restrykcyjnych Hindlll w chromosomie szczepu 898-1 . Szczepy Escherichia coli niosące zrekombinowany plazmid nie wytwarzały pełnej długości flagellina i dane uzyskane z białkami fuzyjnymi FlaA przy użyciu systemu ekspresji plazmidu E. coli sugerują, że odrębna sekwencja nukleotydów w genie zakłóca produktywną translację tego białka w E. coli.

• Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko głównemu białku flageliny Borrelia burgdorferi, flagellinie białkowej o masie 41 kilodaltonów (kDa), zastosowano do monitorowania klonowania i ekspresji genu flageliny z biblioteki genomowej Borrelia burgdorferi.
• Analizowano strukturę genu i wytworzono zrekombinowaną flagelinę niefuzyjną w Escherichia coli. Analiza sekwencji DNA genu flageliny 41 kDa wykazała obecność otwartej ramki odczytu, która kodowała białko mające 336 reszt aminokwasowych i obliczoną masę cząsteczkową 35,8 kDa, co wskazuje na potranslacyjną modyfikację naturalnej flageliny 41 kDa białko.
• W górę od sekwencji kodonu start AUG zidentyfikowaliśmy motywy odpowiadające konsensusowym prokariotycznym elementom promotora, które mogą być wykorzystane przez sklonowany gen flageliny, gdy jest eksprymowany w E. coli MC1061. Wydedukowana sekwencja białka flageliny wykazywała wysoki poziom homologii z sekwencjami białek flageliny z Bacillus subtilis i Salmonella typhimurium.
• Poziomy podobieństwa sekwencji dla części na końcu aminowym i karboksylowym wynosiły odpowiednio około 65 i 56%. Informacje o sekwencji DNA genu flageliny zostały wykorzystane do zaprojektowania oligonukleotydów do amplifikacji genu metodą reakcji łańcuchowej polimerazy, a przy użyciu tej metody można było wykryć 0,01 pg DNA Borrelia burgdorferi. Nasze wyniki stanowią podstawę do dalszej analizy biochemicznej białka flageliny o masie 41 kDa, badania roli tego białka w oddziaływaniach gospodarz-patogen oraz opracowania standaryzowanego odczynnika do systemów diagnostycznych dla zakażeń Borrelia burgdorferi.

Flagellina, monomeryczna podjednostka wici, jest induktorem mediatorów prozapalnych.

Bakteryjne geny flageliny mają konserwatywne domeny (D1 i D2) na końcu N i końcu C oraz środkową domenę hiperzmienną (D3). Aby zidentyfikować, które domeny indukują aktywność prozapalną, z genu flageliny Salmonella dublin (SD) fliC wytworzono znakowane r6-histydyną (6HIS) konstrukty fuzyjne. Pełnej długości flagelina r6HIS SD (flaga 6HIS) indukowała po stymulacji utratę IkappaBalpha i aktywację NF-kappaB w komórkach Caco-2BBe i była tak silna jak natywnie oczyszczona flagelina SD. Komórki DLD-1 stymulowane IFN-gamma stymulowane 1 mikrog/ml flagi 6HIS indukowały wysokie poziomy NO (60 +/- 0,95 mikroM) porównywalne z kombinacją IL-1beta i IFN-gamma (77 +/- 1,2) lub oczyszczona natywna flaga SD (66,3 +/- 0,98).

Wybrane białka flageliny rSD reprezentujące domeny D1, D2 lub D3 pojedynczo lub w połączeniu przetestowano pod kątem właściwości prozapalnych. Białka fuzyjne reprezentujące same regiony D3, aminowe lub karboksylowe nie indukowały mediatorów prozapalnych. Wyniki z rekombinowanym białkiem zawierającym aminokwasy D1 i D2 oraz karboksyl D1 i D2 oddzielone zawiasem Escherichia coli (ND1-2/ECH/CD2) wskazywały, że D1 i D2 były bioaktywne po sprzężeniu z elementem ECH, aby umożliwić zwijanie białka. Ta chimera, ale nie sam zawias, indukowała degradację IkappaBalpha, aktywację NF-kappaB oraz wytwarzanie NO i IL-8 w dwóch liniach komórek nabłonka jelitowego.

ND1-2/ECH/CD2-1 indukował również wysokie poziomy TNF-alfa (900 pg/ml) w ludzkich monocytach porównywalne z natywną flageliną SD (991,5 pg/ml) i flagą 6HIS (987 pg/ml). Silna prozapalna aktywność flageliny znajduje się zatem w wysoce konserwatywnych regionach D1 i D2 N i C.